qPCR常見問題彙整

即時定量PCR(real-time PCR ; qPCR)是一種利用PCR擴增的原理，使極微量的cDNA放大，再經由光學系統達到即時偵測基因表現量的一項技術，qPCR是一種應用性非常廣泛的生物實驗技術，因為qPCR具有專一性高、操作過程短、成本低廉等優點，因此常應用於臨床診斷或是基因檢測等工具。圖爾思技術服務中心擁有經驗豐富的qPCR技術服務經驗，這邊就為大家整理進行qPCR實驗常見的問題與解決方式：

• 無Ct值出現：通常為primer或是probe發生降解，這個時候我們可以把primer或是probe去跑PAGE確認。另外，樣品模版(template)的量不足時也會造成沒有Ct值出現，因此使用可靠的cDNA synthesis kit是必須的。最後，請注意cDNA並沒有你想像中的堅強，所以請盡量避免cDNA模版的反覆凍溶或是用存放過久的cDNA模版來進行qPCR實驗。

• Ct值出現過晚(>38)：通常是qPCR的擴增反應不夠好，例如：設計不當的primer或是probe、使用的qPCR反應試劑不優良、或是設計的PCR產物過長(>150bp)都會造成Ct值出現過晚。

• 標準曲線線性不佳：在qPCR的世界中添加qPCR反應組成份的手非常的重要，若加樣的過程中不一致產生誤差時就非常容易出現標準曲線線性不佳的狀況發生。另外，標準品的降解也是常見的小狀況，因此，標準品也建議不要反覆凍溶。最後，若模版中存在有抑制物的話，也容易導致濃度過高而使標準曲線不標準。

• melting curve不只一個peak或是negative control有訊號：通常最常出現這個現象的原因就是primer或是probe設計不良，導致在反應的過程中其形成primer dimer或是二級結構 ; 另外，primer的濃度並不是越濃越好，所以請把primer的反應濃度調整到試劑說明書的建議 ; 其次，若qPCR反應中的鎂離子濃度過高也會造成這個現象。還有一個近年來被重視的原因就是若模版中有genomic DNA(gDNA)的污染也會造成這個現象，因此請確認在進行cDNA合成時務必去除掉genomic DNA(gDNA)，傳統的去除方式為加入DNase I 作用半小時以上，近年來圖爾思也開發出獨特的配方，可以在五分鐘內去除genomic DNA(gDNA)也是一個非常好的選擇。

• 相同試劑在不同機器上產生不同訊號：每個公司的qPCR試劑最適用的機器都不相同，因此這其實是正常的現象，qPCR我們要在意的地方是控制組與實驗組的對比趨勢，若趨勢相同且擴增效率在90%～110%的話，產生的數據都是可信的。