Western Blot(WB)實驗中常見的問題大解惑

    Western Blot(WB)是進行蛋白質相關研究最常使用的生物技術之一，但卻也是最讓研究者頭痛的實驗技術，雖然Western Blot(WB)的操作流程非常簡單，但最終得到的實驗數據卻往往不盡理想甚至讓研究者懷疑人生。因此，圖爾思藉著在蛋白質研究領域的經驗幫大家整理幾個在進行Western Blot(WB)常見的問題與解決方案，以下的問題皆是模擬客戶向我們尋求協助的口吻：

• 為什麼樣品中沒有目標蛋白質？

1. 細胞中根本就不表達這個目標蛋白質，請查文獻並換一個細胞株
2. 樣品中的蛋白質已經降解了，所以在處理樣品時建議加入PMSF抑制Proteinase的活性
3. 所選擇的抗體(antibody)根本無法辨認目標蛋白質

• 為何我的細胞樣品有的看起來濁濁著甚至有沈澱物？有的卻非常透明清澈？

1. 若您的細胞樣品中的蛋白質沒有完全變性(denature)完全則就可能看起來有沈澱物，這時候建議提高SDS的濃度
2. 有可能是蛋白質的濃度過高，建議可以加入適量的緩衝液稀釋

• 若我的目標蛋白質分子量很小(<10kDa)，請問如何最佳化Western Blot(WB)？

1. 請選擇15%以上的SDS-PAGE跑膠，並選擇0.2um的PVDF membrane進行transfer，同時縮短transfer的時間，或是可以將兩張PVDF membrane重疊進行transfer，transfer buffer中的甲醇濃度可以調高至25%，以上可以得到較好的Western Blot(WB)實驗結果

• 呈色後若目標蛋白質的band非常弱該怎麼辦？

1. 提高樣品的濃度
2. 增加一抗incubation的時間甚至可以考慮在4度環境中incubation一整晚
3. 延長呈色的時間或是延長曝光的時間

• Western Blot(WB)的background很髒，該怎麼辦？

1. 降低樣品的濃度
2. 改變一抗incubation的時間，建議可以4度過夜
3. 增加一抗和二抗incubation後wash的次數和延長wash的時間

• Western Blot(WB)結果一片空白，請問出了什麼問題？

1. 可能是抗體的濃度太低，建議提高抗體的濃度
2. 改變一抗incubation的時間，建議可以4度過夜

• 目標蛋白質band的分子量位置和文獻不同，怎麼會這樣？

1. 有可能是目標蛋白質形成二聚體(dimer)，這時候建議在處理樣品時延長加熱的時間以打開二聚體
2. 目標蛋白質本身經過後修飾作用，例如：醣化、磷酸化等...，這種時候建議可以去相關網站上查詢目標蛋白質的特性，且同時查詢文獻看看別人是否也有相同的情形

• 目標蛋白質無法transfer到membrane上，可是SDS-PAGE可以看到目標蛋白質的band，且protein marker卻可以被transfer到membrane上，怎麼會這樣？

1. 目標蛋白質濃度過低，建議提升濃度
2. transfer的時間過短，增加時間

• 進行磷酸化蛋白質的Western Blot(WB)實驗時是否一定要加入磷酸脢抑制劑：

1. 一定要加，且還需要同時加入proteinase抑制劑

• 一開始進行Western Blot(WB)的實驗時可以看到目標蛋白質的band，但是做了幾次後band越來越模糊甚至消失了，請問是不是抗體的效能越來越差？

1. 同一支效期內的抗體若保存在適當的溫度下是不會發生這樣的情況的
2. 可能是樣品經過重複解凍導致蛋白質降解
3. 採用新鮮樣品進行Western Blot(WB)

• 我的目標蛋白質分子量較大(>200kDa)，請問要如何最佳化Western Blot(WB)？

1. 建議stacking gel使用5%，separating gel使用8%，transfer buffer中的甲醇使用5%

• 若我的樣品來源是組織時，怎樣處理樣品比較好？

1. 這種時候就要特別小心，一定要研磨均勻並且使用超音波處理樣品

• 抗體可以重複使用嗎？

1. 站在我們的立場當然完全不建議，但抗體通常在不重複解凍的狀況下一般情況可以重複使用2~3次(但真心不建議，因為您的時間和樣品是最珍貴的)

• 進行transfer時為什麼分子量較大的蛋白質效果通常比較不好？

1. 這是正常的，因為大分子量的蛋白質本來就比較不容易transfer，因此建增加transfer的時間

• 進行Western Blot(WB)實驗時是否一定要同時做internal control?

1. 這是基本常識，一定要，不解釋

• Western Blot(WB)結果為什麼background很高？

1. blocking不完全，建議延長時間
2. 一抗的稀釋倍數不適當，因此建議對抗體進行梯度稀釋倍數測試
3. 一抗的incubation溫度偏高，建議可以改4度過夜
4. 呈色的時間過長
5. 曝光的時間過長

• 如何才能把SDS-PAGE跑得又直又漂亮？

1. 跑膠時建議使用較小的電壓，我們建議上層用55V，下層用75V
2. 配SDS-PAGE時請務必混合均勻，玻璃一定要洗乾淨

• Western Blot(WB)的結果出現很多band，怎麼會這樣？

1. 目標蛋白質有多個修飾位點
2. 目標蛋白質可能會被剪切成多個片段
3. 樣品處理不佳導致蛋白質降解
4. 樣品濃度太高，導致抗體太敏感
5. 降低一抗與二抗的濃度

以上，都是我們常常接到客戶的問題，這邊僅提供圖爾思技術服務經驗法則供大家參考～

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