如何設計優良的qPCR primer
qPCR生物技術是一種用來偵測mRNA表達量最可靠也最常用的技術之一，qPCR作為PCR技術的分支其primer的設計也同樣必須遵循PCR primer設計的規則，如此一來才能得到可靠品質高的實驗數據，qPCR定量方式一般分為 SYBR 和 Probe 系統(例如：TagMan...)，今天就先跟大家介紹SYBR primer的設計規則，當您在設計primer時必須要注意下面幾項重點：
1. primer的長度一般落在17~25個鹼基，且GC含量在40%~60%之間為佳。
2. primer 3' 端最後一個鹼基對於Taq酵素的合成效率有很大的關連，一般來說最後一個鹼基為A的錯誤配對會明顯高於其他三種鹼基，其次最後一個鹼基為T的錯誤配對次之，因此您在設計primer時應盡量避免於3'端最後一個鹼基選擇A或T ; 除此之外，設計primer也要避免primer自身產生二級結構以避免primer無法和目標序列配而導致實驗失敗。而5'端的序列對於qPCR的反應效能較無影響，因此常用來作為primer修飾或是接上標誌物。
3. primer的鹼基最好隨機分布，應盡量避免連續4個鹼基的primer間自行配對的現象發生。
4. primer的Tm值最好落在72度左右，而實驗中denature的溫度可以根據primer最低的Tm值進行設定。
5. ∆G值指形成DNA雙股所需要的能量，因此在設計primer時盡量選擇primer 3'端∆G值較低的primer(盡量不要超過9)以避免和目標序列產生錯誤配對。相反的primer 5 '端則盡量選擇∆G值相對高的primer。
6. primer dimer 與 hairpain 結構的產生會干擾qPCR實驗的效能，因此要絕對避免。
7. 若需要進行primer的修飾千萬不能將修飾放在primer 3'端
8. 針對目標序列或是基因設計primer時，primer最好能跨越一個intron。若您是使用TagMan系統因為實驗中有probe的存在，因此在設計primer時需要特別留意primer 5'端不能有G，因為G會影響螢光的發光量而影響數據，此外，也必須確保probe的denature溫度要比primer高約10度。
以上為進行qPCR primer設計需要注意的幾個重要事項。
